质粒DNA的大量提取、纯化及棉花的遗传转化

实验试剂
1. STE [0.1 mol/L NaCI、10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), 1 mmol/LEDTA (pH 8.0)]
2. 溶液I [50 mmol/L蔗糖、25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), 10 mmol/L EDTA (pH8.0)]
3. 溶液II (0.4 mol/L NaOH和2%SDS等量混匀)
4. 溶液III (3 mol/L Kac, pH 4.8)
5. 异丙醇
6. 4 mol/L LiCI
7. RNase
8. 苯酚、酚-氯仿、氯仿
9. 乙醇
实验设备
1. 摇床
2. 制冰机
3. 高速离心机
4. 水浴锅
5. 超净工作台
6. 玻璃毛细管
7. 微量注射器
实验材料
棉花，转化农杆菌菌株
实验步骤
1. 37℃, 250 rpm摇菌500 ml。
2. 5000 × g离心5 min以收集菌体，用50 ml STE洗涤菌体一次。
3. 加入溶液I 20 ml悬浮菌体。
4. 加溶液II40 ml，轻轻将离心管颠倒几次，置冰浴20 min。
5. 加预冷的溶液III30 ml，将离心管颠倒几次，置冰浴10 min以上。
6. 10000 × g离心15 mm，取上清液加入0.6倍体积的的异丙醇，充分混匀后室温放置10 min以上。
7. 10000 × g离心10 min，弃上清。待沉淀干燥后用350ul水溶解，加350 ul 4 mol/L LiCI，混匀后室温放置10 min以上。
8. 10000 × g离心5 min，取上清液加入RNase至终浓度为100 ug/ml，37℃保温2h。
9. 用苯酚、酚-氯仿、氯仿各抽提一次。上清加0.1倍体积的3 mol/L NaAc (pH5.2)及2倍体积的无水乙醇。
10. 离心收集DNA沉淀，70%乙醇洗涤一次。干燥后溶于TE中备用。
11. 棉花的遗传转化:大量的质粒，用无菌水稀释成2 mg/ml的DNA溶液进行子房注射。注射在超净工作台上进行，注射针是玻璃毛细管，顶端直径约为0.1mm。将毛细管另一端紧紧套入10-20ul的微量注射器针头，吸取被注射的DNA样品6-12ul。注射时，将针头对准子房伸出的花丝部分进行。每个子房约注射0.2ulDNA。